ძირითადი მასალა

კურსი: ბიოლოგია > თემა 17

გაკვეთილი 3: დნმ-ს ანალიზის მეთოდი

გელ-ელექტროფორეზი

ტექნიკა, რომელიც დნმ-ს ფრაგმენტებისა და სხვა მაკრომოლეკულების ზომისა და მუხტის მიხედვით განცალკევებისთვის გამოიყოფა.

საკვანძო საკითხები:

გელ-ელექტროფორეზი დნმ-ის ფრაგმენტების ზომის მიხედვით გამოცალკევების მეთოდია.
დნმ-ის ნიმუშები ფოსოებში (ჩაღრმავებებში) თავსდება გელის ერთ ბოლოზე და ფირფიტაზე ელექტრული გენით მოქმედებენ, რათა ნიმუშებმა გელში მოძრაობა დაიწყოს.
დნმ-ის ფრაგმენტები უარყოფითადაა დამუხტული, ამიტომ, ისინი დადებითი ელექტროდისკენ გადაადგილდება. იმის გამო, რომ ფრაგმენტების მასის ერთეულზე მუხტის სიდიდე ერთნაირია, პატარა ფრაგმენტები უფრო სწრაფად მოძრაობენ გელში, ვიდრე დიდები.
გელის დნმ-ის სპეციალური საღებავით შეღებვის შემდეგ ფრაგმენტები ხაზებად (ე. წ. ბენდებად) ჩანს. თითოეულ ხაზში ერთნაირი ზომის დნმ-ფრაგმენტებია თავმოყრილი.

შესავალი

ვთქვათ, ახლახანს ჩაატარეთ პჯრ და დნმ-ის სამიზნე უბნის მრავალი ასლი დაამზადეთ. ან, შესაძლოა, დნმ-ის კლონირება დაასრულეთ და სამიზნე გენი დნმ-ის წრიულ მოლეკულაში, პლაზმიდში, ჩასვით.

ახლა კი გსურთ, შეამოწმოთ, წარმატებული იყო თუ არა პჯრ ან პლაზმიდში საჭირო გენი მოხვდა თუ არა. რა მეთოდს გამოიყენებდით დნმ-ის საკვლები ფრაგმენტის ვიზუალიზაციისთვის (თვალსაჩინოდ დასანახად)?

გელ-ელექტროფორეზი

გელ-ელექტროფორეზი კვლევის მეთოდია, რომელიც გულისხმობს დნმ-ის (ან სხვა მოლეკულების, მაგ. რნმ-ის ან ცილების) ფრაგმენტების განცალკევებას ზომისა და მუხტის მიხედვით. ელექტროფორეზში დენს საკვლევი მოლეკულების შემცველ გელში ატარებენ, რაც იწვევს ამ მოლეკულების გადაადგილებას სხვადასხვა მიმართულებით ან სიჩქარით, მათი ზომისა და მუხტის მიხედვით და საბოლოოდ, მათი ერთმანეთისგან განცალკევებას.

დნმ-ის ყველა მოლეკულის მუხტისა და მასის თანაფარდობა ერთნაირია. ამის გამო, გელ-ელექტროფორეზში დნმ-ის ფრაგმენტები მხოლოდ ზომის მიხედვით გამოცალკევდება ერთმანეთისგან. ამ მეთოდის წყალობით, შეგვიძლია, დავადგინოთ, რამდენნაირი დნმ-ფრაგმენტია ნიმუშში და როგორია მათი ზომები ერთმანეთთან შედარებით. ასევე, შესაძლებელია დნმ-ის მოლეკულის აბსოლუტური ზომის (სიგრძის) დადგენა, თუ მას სტანდარტულ „დნმ-კიბეს" შევადარებთ (იგი სხვადასხვა, წინასწარ ცნობილი ზომის დნმ-ის მოლეკულების ხაზებისგანაა „აწყობილი" და რა ზომის ხაზის გასწვრივაც გაჩერდება ფრაგმენტი, იმ ზომის ყოფილა ისიც.)

ელექტროფორეზში მოლეკულები ორი ფაქტორის მიხედვით განცალკევდება: მუხტი (რაც იზიდავს მათ ელექტროდისკენ) და ეფექტური განივკვეთი (ანუ დახვეულია ისინი, გაშლილი, სხვა მოლეკულებთან დაკავშირებული თუ ა.შ.).

იმის გამო, რომ დნმ-ის ფრაგმენტები ერთისა და იმავე სახის მოლეკულებია, ისინი მხოლოდ ზომის, ანუ სიგრძის, მიხედვით განცალკევდება. ზოგადად, ერთადერთი საგულისხმო განსხვავება ამ ფრაგმენტებს შორის მათი სიგრძე უნდა იყოს.

თუმცაღა, ამ წესს გამონაკლისებიც აქვს. მაგალითად, დნმ-ის ზოგი მოლეკულა წრიულია (მაგ. ბაქტერიული პლაზმიდები), ზოგი კი - ხაზოვანი. წრიული დნმ ხაზოვანისგან განსხვავებულად გადაადგილდება გელში. პლაზმიდები, მაგალითად, შესაძლოა, „სუპერსპირალიზებული" ფორმითაც არსებობდეს. ამ შემთხვევაში ისინი უფრო სწრაფად მოძრაობენ გელში, ვიდრე ზომიდან გამომდინარე იქნებოდა მოსალოდნელი, რადგან სუპერსპირალიზაცია უფრო დაგრეხილ, წვრილ ფორმას ნიშნავს და ასე გადაადგილება უფრო ადვილია.

რა არის გელი?

როგორც სახელწოდებიდან ჩანს, გელ-ელექტროფორეზში გელი გამოიყენება: ჟელესმაგვარი ნივთიერება. დნმ-ის ფრაგმენტების განსაცალკევებელი გელი ხშირად პოლისაქარიდი აგაროზასგან მზადდება. აგაროზა თავიდან მშრალი ფხვნილია, შემდეგ კი მას ბუფერს (წყალი ზოგ მარილთან ერთად) უმატებენ, აცხელებენ და აცივებენ. საბოლოოდ, მიიღება მყარი, ცოტა ჟელესებური კონსისტენციის გელი. მოლეკულურ დონეზე ეს გელი ერთმანეთთან წყალბადური ბმებით დაკავშირებული აგაროზას მოლეკულებისგან შექმნილი „ქსოვილია", შიგ უმცირესი ხვრელებით.

გელის ერთ ბოლოზე ჯიბეებისმაგვარი ჩაღრმავებებია, ფოსოები, რომლებშიც დნმ-ის ნიმუშები თავსდება:

დნმ-ის ნიმუშების დამატებამდე გელი სპეციალურ ფირფიტაში უნდა ჩაისვას. მის ერთ ბოლოზე დადებითი ელექტროდია, მეორეზე კი - უარყოფითი. თავად ფირფიტა, სადაც გელი თავსდება, მარილის შემცველი, დენის გამტარი ბუფერული ხსნარითაა ავსებული. ეს ზედა სურათზე კი არ ჩანს (ჩემი საოცარი ხატვის ნიჭის წყალობით), მაგრამ ბუფერი ფირფიტას ავსებს და თითქმის ფარავს გელს.

გელის ფოსოებიანი ბოლო უარყოფითი ელექტროდისკენ თავსდება, მეორე ბოლო კი (საითაც დნმ-ის ფრაგმენტები გადაადგილდებიან) - დადებითი ელექტროდისკენ.

როგორ მოძრაობენ დნმ-ის ფრაგმენტები გელში?

გელის ფირფიტაში მოთავსების შემდეგ დნმ-ის თითოეული საკვლევი ნიმუში (მაგ. პჯრ-თი მიღებული დნმ ან რესტრიქციული ფერმენტებით დამუშავებული პლაზმიდი) ფრთხილად ისხმევა ფოსოებში. ერთი ფოსო დნმ-ის კიბისთვისაა, სტანდარტული ბილიკისთვის, რომელიც დნმ-ის წინასწარ ცნობილი ზომის ფრაგმენტებს შეიცავს. კომერციული დნმ კიბეებს ზომების სხვადასხვა დიაპაზონი აქვთ, შესაბამისად, ჩვენ უნდა ავარჩიოთ მათგან ისეთი, რომ დნმ-ის საკვლევი ფრაგმენტების მოსალოდნელი ზომები „გადაფაროს".

ამის შემდეგ ფირფიტაში დენი ირთვება და იგი გელში გაივლის. დნმ-ის მოლეკულებს შაქარ-ფოსფატურ ხერხემალში შემავალი ფოსფატის ჯგუფების გამო უარყოფითი მუხტი აქვთ, ამიტომ, ისინი გელში დადებითი პოლუსისკენ გადაადგილდებიან. ელექტროფორეზის მიმდინარეობისას, როცა დენი გელში გადის, ამბობენ ხოლმე, რომ გელი ჩართულია.

აგაროზას გელში დნმ-ის ელექტროფორეზისთვის, როგორც წესი,

80

-

120 ვ

ძაბვა გამოიყენება. უფრო მაღალ ძაბვაზე პროცესი უფრო სწრაფად მიმდინარეობს, მაგრამ ამან შეიძლება, გელი დაადნოს კიდეც, თუ დენი დიდი ხანი იყო ჩართული. უფრო დაბალ ძაბვაზე დნმ-ის ფრაგმენტებიც ნელა მოძრაობს (ეს ზოგჯერ მოსახერებელია, თუ, მაგალითად, გსურთ, მაშინ მორჩეს ელექტროფორეზი, როცა ლანჩიდან დაბრუნდებით).

სურათი ეფუძნება მსგავს დიაგრამას Reece-ისა და კოლეგების ავტორობით. $^{2}$ ‍

ამ დროს დნმ-ის მოკლე ფრაგმენტები უფრო სწრაფად გაივლიან გელის „ქსოვილში" არსებულ ხვრელებს, ვიდრე დიდები. რაღაც პერიოდის შემდეგ დნმ-ის ყველაზე მოკლე მოლეკულები გელის დადებით ბოლოსთან იქნება ახლოს, გრძელები კი - ჯერ კიდევ ფოსოების ახლომახლოს. თუ გელი ზედმეტად დიდხანს დავტოვეთ ჩართული, დნმ-ის ძალიან მოკლე ფრაგმენტები სულაც მეორე ბოლომდე მიაღწევს (ასეთი რამ, ვაღიარებ, დამიშავებია!).

დნმ-ს ფრაგმენტების ვიზუალიზაცია

ფრაგმენტების განცალკევების მერე შეგვიძლია, გელი დავათვალიეროთ და ვნახოთ, რა ზომის ხაზებია მასზე. გელის დნმ-ს საღებავით შეღებვის შემდეგ იგი ულტრაიისფერი სხივების ქვეშ თავსდება. ამ დროს დნმ-ის ფრაგმენტები ნათებას გამოსცემს და ვხედავთ გელის მთელ სიგრძეზე, სხვადასხვა მონაკვეთებზე არსებულ დნმ-ს.

წესით, გელში ჩანს კარგად გამოკვეთილი ხაზები, ანუ ბენდები. თითოეულ ხაზში დნმ-ის ერთნაირი ზომის მრავალი ფრაგმენტია მოთავსებული, რომლებიც ერთი სიჩქარით გადაადგილდნენ და ერთ ადგილას დაგროვდნენ. დნმ-ის ერთი ფრაგმენტი (ან მათი პატარა ჯგუფიც კი) გელზე არ გამოჩნდებოდა.

ხაზების დნმ-ის კიბესთან შედარებით მათში არსებული ფრაგმენტების ზომების დადგენაა შესაძლებელი. მაგალითად, ზედა სურათზე მკვეთრად მანათობელი ხაზი დაახლოებით

700

ფუძეთა წყვილის (ფწ) სიგრძის ფრაგმენტებისგან შედგება.

შეამოწმეთ თქვენი ცოდნა

ზემოთ მოცემული გელის ოთხი ბილიკი დანომრილია. (ბილიკი „დერეფანია", რომელშიც დნმ გაივლის ფოსოს დატოვების შემდეგ.)

შეუსაბამეთ თითოეული წინადადება რომელიმე ბილიკს

	$1$ ‍	$2$ ‍	$3$ ‍	$4$ ‍
ეს ბილიკი დნმ-ის ყველაზე გრძელ ფრაგმენტს შეიცავს.
ეს ბილიკი დნმ-ის ყველაზე მოკლე ფრაგმენტს შეიცავს.
ეს ბილიკი დნმ-ის ფუძეთა $1500$ ‍ წყვილს (ფწ) შეიცავს.

დნმ-ის გელზე დნმ-ის ყველაზე გრძელი ფრაგმენტები ყველაზე ნელა გადაადგილდება და ჯიბესთან ყველაზე ახლოს რჩება (იქ, სადაც თავიდან მოთავსდა გელზე). დნმ-ის ყველაზე მოკლე ფრაგმენტები კი სწრაფად გადააგილდება და მის ბოლოს ყველაზე მეტად უახლოვდება (ჯიბეებისგან შორს).

შესაბამისად, ყველაზე გრძელი ფრაგმენტის შესაბამისი ხაზი გელის ზედა ბოლოსთან ყველაზე ახლოს იქნება. ეს ხაზი

1

-ელ ბილიკშია.

ამავე პრინციპით, ყველაზე მოკლე ფრაგმენტის შესაბამისი ხაზი გელის ქვედა ბოლოსთან ყველაზე ახლოს იქნება. ეს ხაზი მე-

2

ბილიკზეა.

იმის დასადგენად, თუ რომელი ბილიკი შეიცავს

1500

ფწ ხაზს, შეგვიძლია, დნმ-ის კიბე გამოვიყენოთ (ყველაზე მარცხენა ბილიკი). თუ ჩვენ კიბის

1500

ფწ ხაზს გავაყოლებთ თვალს მარჯვნივ, ბილიკების გადაღმა, შესაბამისი ზომის ხაზს მე-

3

ბილიკში დავინახავთ.

	$1$ ‍	$2$ ‍	$3$ ‍	$4$ ‍
ეს ბილიკი დნმ-ის ყველაზე გრძელ ფრაგმენტს შეიცავს.
ეს ბილიკი დნმ-ის ყველაზე მოკლე ფრაგმენტს შეიცავს.
ეს ბილიკი დნმ-ის ფუძეთა $1500$ ‍ წყვილს (ფწ) შეიცავს.

ატრიბუცია:

მოდიფიცირებული სტატიის თავდაპირველი ვერსიებია:

„დნმ-ის კლონირება - რთული," მფლობელი CK-12 Foundation (CC BY-NC 3,0).
„ბიოტექნოლოგია, მფლობელი ოპენსტაქსის კოლეჯი, ბიოლოგია (CC BY 4,0). გადმოწერეთ თავდაპირველი სტატია უფასოდ ვებსაიტიდან http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@10,8.

სახეცვლილი სტატია ვრცელდება CC BY-NC-SA 4,0 ლიცენზიით.

ციტირებული შრომები:

ფორეზი. (14 აპრილი, 2016). მოძიების თარიღი და ადგილი: 31 მაისი, 2015 Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Phoresis.
Reece, J. B., Taylor, M. R., Simon, E. J., and Dickey, J. L. (2012). Figure 12,13. Gel electrophoresis of DNA. In Campbell biology: Concepts & connections (7th ed., p. 243).

წყაროები:

აგაროზა. (19 იანვარი, 2015). მოძიების თარიღი და ადგილი: 3 აპრილი, 2016, Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Agarose.

Gel electrophoresis. (2014). In Scitable. წყარო http://www.nature.com/scitable/definition/gel-electrophoresis-286.

Kratz, R. F. and Siegfried, D. R. (2010). Using gel electrophoresis to separate molecules. In Biology for dummies (2nd ed., pp. 132-133). Hoboken, NJ: John Wiley & Sons.

Oswald, N. (6 აგვისტო, 2008). Agarose gels do not polymerize! In Bitesize Bio. წყარო http://bitesizebio.com/10248/agarose-gels-do-not-polymerise/.

Reece, J. B., Taylor, M. R., Simon, E. J., and Dickey, J. L. (2012). Gel electrophoresis sorts DNA molecules by size. In Campbell biology: Concepts & connections (7th ed., p. 243).

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Using restriction enzymes to make a recombinant DNA plasmid. In Campbell biology (10th ed., pp. 413-414). San Francisco, CA: Pearson.

გსურთ, შეუერთდეთ დისკუსიას?

შესვლა

დავალაგოთ:

პოსტები ჯერ არ არის.

გესმით ინგლისური? დააწკაპუნეთ აქ და გაეცანით განხილვას ხანის აკადემიის ინგლისურენოვან გვერდზე.