ძირითადი მასალა
ბიოლოგია
კურსი: ბიოლოგია > თემა 17
გაკვეთილი 3: დნმ-ს ანალიზის მეთოდიგელ-ელექტროფორეზი
ტექნიკა, რომელიც დნმ-ს ფრაგმენტებისა და სხვა მაკრომოლეკულების ზომისა და მუხტის მიხედვით განცალკევებისთვის გამოიყოფა.
საკვანძო საკითხები:
- გელ-ელექტროფორეზი დნმ-ის ფრაგმენტების ზომის მიხედვით გამოცალკევების მეთოდია.
- დნმ-ის ნიმუშები ფოსოებში (ჩაღრმავებებში) თავსდება გელის ერთ ბოლოზე და ფირფიტაზე ელექტრული გენით მოქმედებენ, რათა ნიმუშებმა გელში მოძრაობა დაიწყოს.
- დნმ-ის ფრაგმენტები უარყოფითადაა დამუხტული, ამიტომ, ისინი დადებითი ელექტროდისკენ გადაადგილდება. იმის გამო, რომ ფრაგმენტების მასის ერთეულზე მუხტის სიდიდე ერთნაირია, პატარა ფრაგმენტები უფრო სწრაფად მოძრაობენ გელში, ვიდრე დიდები.
- გელის დნმ-ის სპეციალური საღებავით შეღებვის შემდეგ ფრაგმენტები ხაზებად (ე. წ. ბენდებად) ჩანს. თითოეულ ხაზში ერთნაირი ზომის დნმ-ფრაგმენტებია თავმოყრილი.
შესავალი
ვთქვათ, ახლახანს ჩაატარეთ პჯრ და დნმ-ის სამიზნე უბნის მრავალი ასლი დაამზადეთ. ან, შესაძლოა, დნმ-ის კლონირება დაასრულეთ და სამიზნე გენი დნმ-ის წრიულ მოლეკულაში, პლაზმიდში, ჩასვით.
ახლა კი გსურთ, შეამოწმოთ, წარმატებული იყო თუ არა პჯრ ან პლაზმიდში საჭირო გენი მოხვდა თუ არა. რა მეთოდს გამოიყენებდით დნმ-ის საკვლები ფრაგმენტის ვიზუალიზაციისთვის (თვალსაჩინოდ დასანახად)?
გელ-ელექტროფორეზი
გელ-ელექტროფორეზი კვლევის მეთოდია, რომელიც გულისხმობს დნმ-ის (ან სხვა მოლეკულების, მაგ. რნმ-ის ან ცილების) ფრაგმენტების განცალკევებას ზომისა და მუხტის მიხედვით. ელექტროფორეზში დენს საკვლევი მოლეკულების შემცველ გელში ატარებენ, რაც იწვევს ამ მოლეკულების გადაადგილებას სხვადასხვა მიმართულებით ან სიჩქარით, მათი ზომისა და მუხტის მიხედვით და საბოლოოდ, მათი ერთმანეთისგან განცალკევებას.
დნმ-ის ყველა მოლეკულის მუხტისა და მასის თანაფარდობა ერთნაირია. ამის გამო, გელ-ელექტროფორეზში დნმ-ის ფრაგმენტები მხოლოდ ზომის მიხედვით გამოცალკევდება ერთმანეთისგან. ამ მეთოდის წყალობით, შეგვიძლია, დავადგინოთ, რამდენნაირი დნმ-ფრაგმენტია ნიმუშში და როგორია მათი ზომები ერთმანეთთან შედარებით. ასევე, შესაძლებელია დნმ-ის მოლეკულის აბსოლუტური ზომის (სიგრძის) დადგენა, თუ მას სტანდარტულ „დნმ-კიბეს" შევადარებთ (იგი სხვადასხვა, წინასწარ ცნობილი ზომის დნმ-ის მოლეკულების ხაზებისგანაა „აწყობილი" და რა ზომის ხაზის გასწვრივაც გაჩერდება ფრაგმენტი, იმ ზომის ყოფილა ისიც.)
რა არის გელი?
როგორც სახელწოდებიდან ჩანს, გელ-ელექტროფორეზში გელი გამოიყენება: ჟელესმაგვარი ნივთიერება. დნმ-ის ფრაგმენტების განსაცალკევებელი გელი ხშირად პოლისაქარიდი აგაროზასგან მზადდება. აგაროზა თავიდან მშრალი ფხვნილია, შემდეგ კი მას ბუფერს (წყალი ზოგ მარილთან ერთად) უმატებენ, აცხელებენ და აცივებენ. საბოლოოდ, მიიღება მყარი, ცოტა ჟელესებური კონსისტენციის გელი. მოლეკულურ დონეზე ეს გელი ერთმანეთთან წყალბადური ბმებით დაკავშირებული აგაროზას მოლეკულებისგან შექმნილი „ქსოვილია", შიგ უმცირესი ხვრელებით.
გელის ერთ ბოლოზე ჯიბეებისმაგვარი ჩაღრმავებებია, ფოსოები, რომლებშიც დნმ-ის ნიმუშები თავსდება:
დნმ-ის ნიმუშების დამატებამდე გელი სპეციალურ ფირფიტაში უნდა ჩაისვას. მის ერთ ბოლოზე დადებითი ელექტროდია, მეორეზე კი - უარყოფითი. თავად ფირფიტა, სადაც გელი თავსდება, მარილის შემცველი, დენის გამტარი ბუფერული ხსნარითაა ავსებული. ეს ზედა სურათზე კი არ ჩანს (ჩემი საოცარი ხატვის ნიჭის წყალობით), მაგრამ ბუფერი ფირფიტას ავსებს და თითქმის ფარავს გელს.
გელის ფოსოებიანი ბოლო უარყოფითი ელექტროდისკენ თავსდება, მეორე ბოლო კი (საითაც დნმ-ის ფრაგმენტები გადაადგილდებიან) - დადებითი ელექტროდისკენ.
როგორ მოძრაობენ დნმ-ის ფრაგმენტები გელში?
გელის ფირფიტაში მოთავსების შემდეგ დნმ-ის თითოეული საკვლევი ნიმუში (მაგ. პჯრ-თი მიღებული დნმ ან რესტრიქციული ფერმენტებით დამუშავებული პლაზმიდი) ფრთხილად ისხმევა ფოსოებში. ერთი ფოსო დნმ-ის კიბისთვისაა, სტანდარტული ბილიკისთვის, რომელიც დნმ-ის წინასწარ ცნობილი ზომის ფრაგმენტებს შეიცავს. კომერციული დნმ კიბეებს ზომების სხვადასხვა დიაპაზონი აქვთ, შესაბამისად, ჩვენ უნდა ავარჩიოთ მათგან ისეთი, რომ დნმ-ის საკვლევი ფრაგმენტების მოსალოდნელი ზომები „გადაფაროს".
ამის შემდეგ ფირფიტაში დენი ირთვება და იგი გელში გაივლის. დნმ-ის მოლეკულებს შაქარ-ფოსფატურ ხერხემალში შემავალი ფოსფატის ჯგუფების გამო უარყოფითი მუხტი აქვთ, ამიტომ, ისინი გელში დადებითი პოლუსისკენ გადაადგილდებიან. ელექტროფორეზის მიმდინარეობისას, როცა დენი გელში გადის, ამბობენ ხოლმე, რომ გელი ჩართულია.
ამ დროს დნმ-ის მოკლე ფრაგმენტები უფრო სწრაფად გაივლიან გელის „ქსოვილში" არსებულ ხვრელებს, ვიდრე დიდები. რაღაც პერიოდის შემდეგ დნმ-ის ყველაზე მოკლე მოლეკულები გელის დადებით ბოლოსთან იქნება ახლოს, გრძელები კი - ჯერ კიდევ ფოსოების ახლომახლოს. თუ გელი ზედმეტად დიდხანს დავტოვეთ ჩართული, დნმ-ის ძალიან მოკლე ფრაგმენტები სულაც მეორე ბოლომდე მიაღწევს (ასეთი რამ, ვაღიარებ, დამიშავებია!).
დნმ-ს ფრაგმენტების ვიზუალიზაცია
ფრაგმენტების განცალკევების მერე შეგვიძლია, გელი დავათვალიეროთ და ვნახოთ, რა ზომის ხაზებია მასზე. გელის დნმ-ს საღებავით შეღებვის შემდეგ იგი ულტრაიისფერი სხივების ქვეშ თავსდება. ამ დროს დნმ-ის ფრაგმენტები ნათებას გამოსცემს და ვხედავთ გელის მთელ სიგრძეზე, სხვადასხვა მონაკვეთებზე არსებულ დნმ-ს.
წესით, გელში ჩანს კარგად გამოკვეთილი ხაზები, ანუ ბენდები. თითოეულ ხაზში დნმ-ის ერთნაირი ზომის მრავალი ფრაგმენტია მოთავსებული, რომლებიც ერთი სიჩქარით გადაადგილდნენ და ერთ ადგილას დაგროვდნენ. დნმ-ის ერთი ფრაგმენტი (ან მათი პატარა ჯგუფიც კი) გელზე არ გამოჩნდებოდა.
ხაზების დნმ-ის კიბესთან შედარებით მათში არსებული ფრაგმენტების ზომების დადგენაა შესაძლებელი. მაგალითად, ზედა სურათზე მკვეთრად მანათობელი ხაზი დაახლოებით 700 ფუძეთა წყვილის (ფწ) სიგრძის ფრაგმენტებისგან შედგება.
შეამოწმეთ თქვენი ცოდნა
ზემოთ მოცემული გელის ოთხი ბილიკი დანომრილია. (ბილიკი „დერეფანია", რომელშიც დნმ გაივლის ფოსოს დატოვების შემდეგ.)
შეუსაბამეთ თითოეული წინადადება რომელიმე ბილიკს
გსურთ, შეუერთდეთ დისკუსიას?
პოსტები ჯერ არ არის.