ძირითადი მასალა
ბიოლოგია
მიმოხილვა: დნმ-ს კლონირება
დნმ-ს კლონირების განმარტება, მიზანი და ძირითადი ეტაპები.
საკვანძო საკითხები:
- დნმ-ის კლონირება მოლეკულური ბიოლოგიის ტექნიკაა, რომლის მეშვეობითაც ვიღებთ დნმ-ის ნაწილის, მაგალითად, გენის, ბევრ იდენტურ ასლს.
- კლონირების ტიპურ ექსპერიმენტში სამიზნე გენი ისმება დნმ-ის წრიულ მოლეკულაში, რომელსაც პლაზმიდი ეწოდება.
- პლაზმიდი ბაქტერიებში ტრანსფორმაციის პროცესის შედეგად ხვდება და პლაზმიდის მატარებელი ბაქტერიები ანტიბიოტიკების გამოყენებით შეირჩევა.
- შესაფერისი პლაზმიდის მქონე ბაქტერიები გამოიყენება უფრო მეტი პლაზმიდური დნმ-ის წარმოსაქმნელად და, ზოგ შემთხვევაში, ინდუცირდება (ხელოვნურად სტიმულირდება) გენის ექსპრესიისა და ცილების საწარმოებლად.
შესავალი
როდესაც გესმით სიტყვა „კლონირება“, ალბათ, მთლიანი ორგანიზმების, მაგალითად, ცხვარი დოლის, კლონირებაზე ფიქრობთ. მიუხედავად ამისა, რაღაცის კლონირება მხოლოდ მისი გენეტიკურად იდენტური ასლის წარმოქმნას გულისხმობს. მოლეკულური ბიოლოგიის ლაბორატორიაში ყველაზე ხშირად გენი ან დნმ-ის სხვა მცირე ნაწილი კლონირდება.
თუკი მოლეკულური ბიოლოგიის დარგში მომუშავე მეგობარმა გითხრათ, რომ „კლონირებამ“ არ იმუშავა, ის, დიდი ალბათობით, დნმ-ის პატარა ნაჭრების კლონირებაზე საუბრობს და არა — ახალი დოლის შექმნაზე!
დნმ-ის კლონირების მიმოხილვა
დნმ-ის კლონირება არის დნმ-ის ცალკეული ნაწილის რამდენიმე იდენტური ასლის წარმოქმნის პროცესი. დნმ-ის კლონირების ტიპური პროცედურის დროს ჩვენთვის საინტერესო გენი ან დნმ-ის სხვა ფრაგმენტი (მაგალითად, ადამიანის სამედიცინო თვალსაზრისით მნიშვნელოვანი ცილის გენი) ჯერ ისმება დნმ-ის წრიულ მოლეკულაში, რომელსაც პლაზმიდი ეწოდება. ეს ჩასმა ხორციელდება იმ ფერმენტით, რომელიც „ჭრის და სვამს“ დნმ-ს და წარმოქმნის რეკომბინაციული დნმ-ის მოლეკულას, ანუ ისეთ დნმ-ს, რომელიც სხვადასხვა წყაროდან აღებული ფრაგმენტების შეერთებით მიიღება.
შემდეგ რეკომბინაციული პლაზმიდი ბაქტერიებში შეყავთ. პლაზმიდის მატარებელი ბაქტერიები გადაირჩევა და გამოიზრდება. გამრავლებასთან ერთად ისინი ახალ პლაზმიდებსაც წარმოქმნიან და შთამომავლობას გადასცემენ, რითიც იქმნება მათში არსებული დნმ-ის ასლები.
რა აზრი აქვს პლაზმიდში არსებული დნმ-ის მიმდევრობის მრავალი ასლის წარმოქმნას? ზოგ შემთხვევაში ჩვენ დნმ-ის დიდი რაოდენობით ასლები გვჭირდება ექსპერიმენტების ჩასატარებლად ან ახალი პლაზმიდების შესაქმნელად. სხვა შემთხვევებში დნმ-ის ნაწილი აკოდირებს საჭირო ცილას და ბაქტერიები ცილის საწარმოებელი „ქარხნების“ როლს ასრულებენ. მაგალითად, ადამიანის ინსულინის გენი ექსპრესირდება E. coli ბაქტერიებში, რათა წარმოიქმნას ინსულინი, რომლითაც დიაბეტის მქონე პაციენტები სარგებლობენ.
დნმ-ის კლონირების ეტაპები
დნმ-ის კლონირებას ბევრი პრაქტიკული გამოყენება აქვს. მაგალითისთვის, ვნახოთ, როგორ გამოიყენება დნმ-ის კლონირება ბაქტერიებში ცილის (მაგალითად, ადამიანის ინსულინის) სინთეზისთვის. ძირითადი ეტაპებია:
- პლაზმიდი იხსნება და მასში გენი „ისმება“. ეს პროცესი დამოკიდებულია რესტრიქციულ ფერმენტებსა (რომლებიც ჭრის დნმ-ს) და დნმ-ლიგაზაზე (რომელიც უერთდება დნმ-ს).
- პლაზმიდი ბაქტერიებში შეყავთ. გამოიყენება ანტიბიოტიკის მეშვეობით გადარჩევა, რათა მოხდეს პლაზმიდის მქონე ბაქტერიების იდენტიფიცირება.
- ხდება პლაზმიდის მატარებელი მრავალი ბაქტერიის გამოზრდა და მათი ცილის საწარმოებელ „ქარხნებად“ გამოყენება. ცილებს იღებენ ბაქტერიებიდან და წმენდენ.
მოდით, უფრო დაწვრილებით შევისწავლოთ თითოეული ნაბიჯი.
1. დნმ-ის ამოჭრა და ჩაკერება
როგორაა შესაძლებელი სხვადასხვა წყაროდან აღებული დნმ-ის ფრაგმენტების გაერთიანება? ყველაზე ხშირი მეთოდი ორი ტიპის ფერმენტებს იყენებს: რესტრიქციულ ფერმენტებსა და დნმ-ლიგაზას.
რესტრიქციული ფერმენტი არის დნმ-ის მჭრელი ფერმენტი, რომელსაც შეუძლია ცალკეული სამიზნე მიმდევრობის ამოცნობა და ამ უბნის მახლობლად დნმ-ის ორ ნაწილად დაჭრა. მრავალი რესტრიქციული ფერმენტი ისეთ მოჭრილ ბოლოებს წარმოქმნის, რომლებსაც მოკლე, ერთჯაჭვიანი შვერილები აქვთ. თუკი ორ მოლეკულას ურთიერთშესაბამისი შვერილები აქვს, მათ შეუძლათ ფუძეთა შეწყვილება და გაერთიანება. მიუხედავად ამისა, ისინი არ ერთიანდებიან დნმ-ის უწყვეტი მოლეკულის წარმოსაქმნელად მანამ, სანამ საქმეში დნმ-ლიგაზა არ ჩაერთვება, რომელიც მჭიდროდ კრავს დნმ-ის ჩონჩხში არსებულ რღვეულებს.
კლონირებისას ჩვენი მიზანია სამიზნე გენის (მაგ., ადამიანის ინსულინის გენის) პლაზმიდში ჩასმა. საგულდაგულოდ შერჩეული რესტრიქციული ფერმენტის გამოყენებით ჩვენ ვაქუცმაცებთ:
- პლაზმიდს, რომელსაც ჭრის ერთი უბანი აქვს
- სამიზნე გენის ფრაგმენტს, რომელსაც ორივე ბოლოში აქვს ჭრის უბანი
შემდეგ ამ ფრაგმენტებს დნმ-ლიგაზას ვურთავთ, ეს უკანასკნელი კი მათ ერთმანეთზე აბამს და გენის შემცველ რეკომბინაციულ პლაზმიდს წარმოქმნის.
2. ბაქტერიული ტრანსფორმაცია და სელექცია
ტრანსფორმაციის პროცესის მეშვეობით პლაზმიდებისა და სხვა დნმ-ის შეყვანა შეგვიძლია ბაქტერიებში, მაგალითად, ისეთ უწყინარ ბაქტერიაში, როგორიცაა E. coli, რომელიც ლაბორატორიებში გამოიყენება. ტრანსფორმაციის დროს სპეციალურად მომზადებული ბაქტერიული უჯრედები იღებენ შოკს (მაგალითად, სითბურს), რომელიც მათ უცხო დნმ-ის მიღებისკენ უბიძგებს.
ჩვეულებრივ, პლაზმიდი შეიცავს ანტიბიოტიკისადმი მდგრადობის გენს, რომელიც ბაქტერიას მის გარემოში განსაზღვრული ანტიბიოტიკის თანაობისას გადარჩენის საშუალებას აძლევს. ამგვარად, ბაქტერიები, რომლებიც პლაზმიდს იღებენ, შეიძლება, გადაირჩეს იმ საკვებ ნიადაგებში, რომლებიც ანტიბიოტიკს შეიცავს. პლაზმიდის არმქონე ბაქტერიები დაიხოცებიან, მისი მქონე ინდივიდები კი გააგრძელებენ არსებობას და გამრავლდებიან. თითოეული გადარჩენილი ბაქტერია წარმოქმნის ერთისა და იმავე პლაზმიდის მატარებელი იდენტური ბაქტერიების პატარა, წერტილის მსგავს ჯგუფებს, ანუ კოლონიებს.
ყველა კოლონიას აუცილებლად არ ექნება შესაფერისი პლაზმიდი, რადგან ლიგირების დროს დნმ-ის ფრაგმენტები ყოველთვის ჩანაფიქრისამებრ არ ისმება. ნაცვლად ამისა, ჩვენ გვიწევს, რამდენიმე კოლონიიდან შევაგროვოთ დნმ და ვნახოთ, თითოეულს სწორი პლაზმიდი აქვს თუ არა. პლაზმიდების შესამოწმებლად ძირითადად რესტრიქციული ფერმენტით დაქუცმაცება და პჯრ გამოიყენება.
3. ცილების წარმოება
როდესაც შესაფერისი პლაზმიდის მქონე ბაქტერიულ კოლონიას აღმოვაჩენთ, შეგვიძლია, პლაზმიდის მატარებელი ბაქტერიების დიდი კულტურა გამოვზარდოთ. შემდეგ ჩვენ ბაქტერიებს ქიმიურ სიგნალს ვაძლევთ, რომელიც მათ სამიზნე ცილის წარმოქმნისკენ მიუთითებს.
ეს ბაქტერიები მინიატურული „ქარხნების“ როლს ასრულებენ და ავტომატურად აწარმოებენ დიდი რაოდენობით ცილებს. მაგალითად, თუკი ჩვენს პლაზმიდს ადამიანის ინსულინის გენი ჰქონდა, ბაქტერიები დაიწყებენ ამ გენის ტრანსკრიბირებასა და ი-რნმ-ის ტრანსლაციას, რათა წარმოქმნან ადამიანის ცილა ინსულინის მრავალი მოლეკულა.
ცილის წარმოქმნის შემდეგ მის გამოსათავისუფლებლად ბაქტერიული უჯრედების გახლეჩა შეგვიძლია. სამიზნე ცილის (მაგ., ინსულინის) გარდა ბაქტერიებში მრავალი სხვა ცილა და მაკრომოლეკულაა. ამის გამო სამიზნე ცილა უნდა გაიწმინდოს, ანუ ბიოქიმიური ტექნიკების მეშვეობით განცალკევდეს უჯრედის სხვა შიგთავსისგან. გაწმენდილი ცილის გამოყენება უკვე შესაძლებელია ექსპერიმენტებში ან, ინსულინის შემთხვევაში, პაციენტთა დასახმარებლად.
დნმ-ის კლონირების გამოყენება
კლონირების ტექნიკებით მიღებული დნმ-ს მოლეკულები მოლეკულურ ბიოლოგიაში სხვადასხვა დანიშნულებით გამოიყენება. მაგალითების მოკლე სია:
- ბიოფარმაცევტიკა. შეგვიძლია, დნმ-ის კლონირება ადამიანის ცილების საწარმოებლად გამოვიყენოთ ბიოსამედიცინო მიზნებისთვის, როგორიც, მაგალითად, ზემოთ ნახსენები ინსულინი იყო. რეკომბინაციული ცილების სხვა მაგალითებს შორისაა ადამიანის ზრდის ჰორმონი (სომატოტროპინი), რომელსაც ის პაციენტები იღებენ, რომლებსაც მისი სინთეზირება არ შეუძლიათ, და პლაზმინოგენის ქსოვილოვანი აქტივატორი (პქა), რომელიც ტვინში სისხლის ჩაქცევის სამკურნალოდ და თრომბის თავიდან ასაცილებლად გამოიყენება. მსგავსი რეკომბინაციული ცილები ხშირად ბაქტერიებში იწარმოება.
- გენური თერაპია. ზოგიერთი გენეტიკური დარღვევის დროს პაციენტებს არ აქვთ ცალკეული გენის ფუნქციონირებადი ფორმა. გენური თერაპიის მიზანია პაციენტის სხეულის უჯრედებისთვის გენის ნორმალური ასლის შექმნა. მაგალითად, დნმ-ის კლონირება გამოიყენებოდა ისეთი პლაზმიდების ასაგებად, რომლებსაც ექნებოდა ცისტური ფიბროზის დროს არაფუნქციონირებადი გენის ნორმალური ვერსია. როდესაც პლაზმიდები ცისტური ფიბროზის მქონე პაციენტების ფილტვებს მიეწოდებოდა, ფილტვების ფუნქციონირება ნაკლები სიჩქარით უარესდებოდაsquared.
- გენეტიკური ანალიზი. კვლევით ლაბორატორიებში ბიოლოგები დნმ-ს კლონირებას ხშირად იყენებენ გენების ხელოვნური, რეკომბინაციური ვერსიების მისაღებად, რომლებიც გვეხმარება, გავიგოთ, თუ როგორ მუშაობს ნორმალური გენი ორგანიზმში.
ეს მხოლოდ რამდენიმე მაგალითია იმისა, თუ როგორ გამოიყენება დღეს ბიოლოგიაში დნმ-ის კლონირება. დნმ-ის კლონირება ძალიან ხშირი ტექნიკაა, რომელსაც მოლეკულურ ბიოლოგიაში მრავალი სხვადასხვა პრაქტიკული გამოყენება აქვს.
გსურთ, შეუერთდეთ დისკუსიას?
პოსტები ჯერ არ არის.