ძირითადი მასალა
ბიოლოგია
კურსი: ბიოლოგია > თემა 17
გაკვეთილი 3: დნმ-ს ანალიზის მეთოდიპოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (პჯრ)
დნმ-ის სპეციფიკური, სამიზნე რეგიონის ამპლიფიკაციის, ანუ, მრავალი ასლის მიღების მეთოდი.
საკვანძო საკითხები:
- პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია, ანუ პჯრ კვლევის მეთოდია, რომელიც გულისხმობს დნმ-ის განსაზღვრული უბნის მრავალი ასლის დამზადებას ინ ვიტრო (ანუ სინჯარაში და არა ორგანიზმში).
- პჯრ-ის მოლეკულური საფუძველია თერმოსტაბილური დნმ-პოლიმერაზა, Taq პოლიმერაზა და დნმ-ის პრაიმერები, რომლებიც სპეციალურად დნმ-ის სამიზნე უბნისთვის იქმნება.
- პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია მრავალჯერ მეორდება, რასაც ტემპერატურის ციკლური ცვლილება ახლავს თან. ამის წყალობით შედეგად სამიზნე უბნის მრავალი ასლი წარმოიქმნება.
- პჯრ მრავალმხრივ გამოიყენება კვლევებსა და პრაქტიკაში. მას ხშირად იყენებენ დნმ-ის კლონირებაში, სამედიცინო დიაგნოსტიკასა და დნმ-ის სასამართლო ექსპერტიზაში.
რა არის პჯრ?
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (პჯრ) გავრცელებული ხერხია ლაბორატორიაში დნმ-ის რაიმე უბნის უამრავი (მილიონობით ან მილიარდობით) ასლის წარმოსაქმნელად. მკვლევარებს შეუძლიათ, დნმ-ის ნებისმიერი უბანი აარჩიონ სამიზნედ. ეს შეიძლება, იყოს გენი, რომლის ფუნქციასაც მეცნიერი შეისწავლის ან გენეტიკური მარკერი, რომელსაც სასამართლო ექსპერტები იყენებენ დანაშაულის ადგილზე აღმოჩენილი დნმ-ის ეჭვმიტანილის დნმ-თან შესადარებლად.
პჯრ-ის მიზანია, დნმ-ის უბნის ასლების იმ რაოდენობით წარმოქმნა, რომ მათი ანალიზი ან სხვა მხრივ შესწავლა მოხერხდეს. მაგალითად, პჯრ-ით ამპლიფიცირებული (გამრავლებული) დნმ შეიძლება, გამოვიყენოთ სეკვენირებისთვის, გელ-ელექტროფორეზით ვიზუალიზაციისთვის ან კლონირებისთვის და პლაზმიდში ჩასასმელად სხვა ექსპერიმენტებში.
პჯრ ბიოლოგიისა და მედიცინის მრავალ დარგში გამოიყენება, მათ შორის მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევებში, სამედიცინო დიაგნოსტიკასა და ეკოლოგიის ზოგიერთ მიმართულებაშიც კი.
Taq-პოლიმერაზა
ორგანიზმებში მიმდინარე დნმ-ის რეპლიკაციის მსგავსად, პჯრ-საც სჭირდება ფერმენტი დნმ-პოლიმერაზა, რომელიც არსებულ ჯაჭვებს ნიმუშებად იყენებს და მათზე დნმ-ის ახალ ჯაჭვებს აწყობს. დნმ-პოლიმერაზას, რომელსაც პჯრ-ში ვიყენებთ, Taq პოლიმერაზა ეწოდება იმ სითბოგამძლე ბაქტერიის პატივსაცემად, რომლისგანაც ეს ფერმენტი გამოყვეს (Thermus aquaticus).
T. aquaticus ცხელ წყაროებსა და ჰიდროთერმულ დინებებში ცხოვრობს. მისი დნმ-პოლიმერაზა ძალიან სითბოგამძლეა და ყველაზე აქტიური 70, °, start text, C, end text ტემპერატურაზეა (ამ ტემპერატურაზე ადამიანის ან E. coli-ის ფერმენტი არ იმუშავებდა). სწორედ ამ თვისების გამოა Taq-პოლიმერაზა იდეალური პჯრ-ისთვის. როგორც შემდეგ ვნახავთ, ამ პროცესში მაღალი ტემპერატურა მრავალჯერ გამოიყენება ნიმუში დნმ-ის დენატურაციისთვის, ანუ მისი ორ ჯაჭვად დაშლისთვის.
პჯრ პრაიმერები
სხვა დნმ-პოლიმერაზების მსგავსად, Taq-პოლიმერაზაც მხოლოდ მაშინ წარმოქმნის დნმ-ს, თუ პრაიმერები აქვს - ნუკლეოტიდების მოკლე თანმიმდევრობები, რომლებიც დნმ-ის სინთეზის საწყის წერტილს ქმნიან. პჯრ-ში მკვლევარი თავად განსაზღვრავს, დნმ-ის რომელი უბნის ასლების დამზადება, ანუ ამფლიპიკაცია, სურს და სწორედ ამის შესაბამისად არჩევს პრაიმერებსაც.
პჯრ პრაიმერები ერთჯაჭვიანი დნმ-ის პატარა, როგორც წესი, 20 ნუკლეოტიდის სიგრძის ფრაგმენტებია. თითოეულ პჯრ-ში ორი პრაიმერი წარმოიქმნება და ისენი ისეა შექმნილი, რომ სამიზნე უბანი (რომლის ასლებსაც ვამზადებთ) მათ შუაში მოექცეს. სხვანაირად რომ ვთქვათ, წინასწარ სპეციალურად იქმნება ისეთი თანმიმდევრობის პრაიმერები, რომლებიც დნმ-ის ნიმუში ჯაჭვს სამიზნე უბნის აქეთ-იქით დაუკავშირდებიან. პრაიმერებისა და ნიმუში დნმ-ის დაკავშირება კომპლემენტარული ფუძეების დაწყვილების პრინციპს ეფუძნება.
პრაიმერების ნიმუშთან დაკავშირების შემდეგ დნმ-პოლიმერაზა მუშაობას, ანუ პრაიმერების დაგრძელებას, იწყებს. შედეგად, ორ პრაიმერს შორის არსებული დნმ-ის უბნის ასლი წარმოიქმნება.
პჯრ-ის ეტაპები
პჯრ-ის მთავარი ინგრედიენტებია: Taq-პოლიმერაზა, პრაიმერები, ნიმუში დნმ და ნუკლეოტიდები (დნმ-ის საშენი აგურები). ეს ინგრედიენტები სინჯარაში ისხმება ფერმენტისთვის საჭირო კოფაქტორებთან ერთად და ციკლური გათბობისა და გაციების პროცესი იწყება, რის შედეგადაც დნმ სინთეზდება.
ძირითადი საფეხურებია:
- დენატურაცია (96, °, start text, C, end text): გააცხელეთ სინჯარა, რათა დნმ-ის ჯაჭვები დენატურირდეს, ანუ განცალკევდეს. მიიღება ორი ერთჯაჭვიანი დნმ შემდეგი საფეხურისთვის.
- ჰიბრიდიზაცია (55 65°, start text, C, end text): გააგრილეთ სინჯარა, რათა პრაიმერები ერთჯაჭვიანი, ნიმუში დნმ-ის შესაბამის თანმიმდევრობებს დაუკავშირდნენ.
- დაგრძელება (72, °, start text, C, end text): ისევ ასწიეთ ტემპერატურა, რათა Taq-პოლიმერაზამ პრაიმერები დააგრძელოს და დნმ-ის ახალი ჯაჭვები წარმოქმნას.
პჯრ-ში ეს ციკლი, როგორც წესი, 25 35-ჯერ მეორდება, რასაც 2 4 საათი სჭირდება, დნმ-ის სამიზნე უბნის სიგრძის მიხედვით. თუ რეაქცია წარმატებით დასრულდა, სამიზნე უბნის ერთი ასლიდან შეგვიძლია, სულ რამდენიმე ან მილიარდობით ასლი მივიღოთ.
ეს იმიტომ, რომ პჯრ-ის ყოველი გამეორებისას, მარტო საწყისი დნმ კი არა, წინა ეტაპებზე სინთეზირებული ასლებიც გამოიყენება ნიმუშებად. სინჯარაში პრაიმერებისა და Taq-პოლიმერაზას უამრავლი მოლეკულაცაა, შესაბამისად, თითოეული ციკლის შემდეგ დნმ-ის ასლების რიცხვი თითქმის ორმაგდება. ამას ექსპონენციური ზრდა ეწოდება და ქვედა სურათზეა ილუსტრირებული.
გელ-ელექტროფორეზის გამოყენება პჯრ-ის შედეგების ვიზუალიზაციისთვის
პჯრ-ის შედეგების ვიზუალიზაციისთვის (თვალსაჩინოდ დასანახად), როგორც წესი, გელ-ელექტროფორეზს იყენებენ. გელ-ელექტროფორეზი კვლევის მეთოდია, რომლის დროსაც დნმ-ის ფრაგმენტები სპეციალურ გელში მოძრაობენ ელექტრული დენის მოქმედებით და ზომის მიხედვით განცალკევებით ლაგდებიან. ექსპერიმენტში, როგორც წესი, გამოიყენება სტანდარტი, ანუ დნმ-ის კიბე, რომლის მიხედვითაც შემდეგ ფრაგმენტების ზომა განისაზღვრება.
დნმ-ის ერთისა და იმავე ზომის ფრაგმენტები გელში ერთ „ხაზს" ქმნიან, რომლის თვალით დანახვაც შესაძლებელია, თუ გელს დნმ-ის სპეციალური საღებავით შევღებავთ.
ასე მაგალითად, პჯრ-ით მიღებული, 400 ცალი ფუძეთა წყვილის (ფწ) სიგრძის ფრაგმენტი გელში ასე გამოიყურება:
დნმ-ის ხაზი სამიზნე უბნის ძალიან, ძალიან ბევრ ასლს შეიცავს და არა - რამდენიმეს. იმის გამო, რომ დნმ მიკროსკოპული, ანუ ძალიან მცირე ზომის, სტრუქტურაა, მისი ბევრი ასლი უნდა დალაგდეს ერთად, რათა ხაზის თვალით დანახვა შევძლოთ. დიდწილად სწორედ ამიტომაა პჯრ ასეთი მნიშვნელოვანი მეთოდი: მისი წყალობით დნმ-ის სამიზნე უბნის იმდენი ასლი წარმოიქმნება, რომ მათზე მანიპულაციების ჩატარება ხდება შესაძლებელი.
პჯრ-ის გამოყენება
პჯრ საშუალებას გვაძლევს, დნმ-ის სამიზნე თანმიმდევრობის მილიონობით და მილიარდობით ასლი დავამზადოთ, იმდენი, რომ მათი გამოკვლევა სხვა მეთოდებითაც შევძლოთ. მაგალითად, შეგვიძლია პჯრ-ით მიღებული დნმ-ის ვიზუალიზაცია გელ-ელექტროფორეზით, მისი სეკვენირება ან რესტრიქციული ფერმენტებით დამუშავება და კლონირება პლაზმიდით.
პჯრ-ს მრავალ ლაბორატორიაში იყენებენ, ისევე, როგორც სასამართლო სამედიცინო პრაქტიკაში, გენეტიკურ კვლევებსა და დიაგნოსტიკაში. მაგალითად, პჯრ გამოიყენება გენეტიკური დაავადებების კვლევისას მშობლების გენების ამფლიპიკაციისთვის (ან ნაყოფის დნმ-ის საკვლევად, პრენატალური დიაგნოსტიკის შემთხვევაში). პჯრ-ს იყენებენ იმის დასადგენად, პაციენტის ორგანიზმში რაიმე ბაქტერია ან ვირუსი არის თუ არა: თუ პათოგენი არის, მისი დნმ-ის უბნების ამფლიპიკაციაც შეიძლება სისხლიდან ან ქსოვილიდან აღებული მასალიდან.
მაგალითი: პჯრ სასამართლო მედიცინაში
ვთქვათ, სასამართლო მედიცინის ლაბორატორიაში მუშაობთ. ახლახანს დნმ-ის ნიმუში მიიღეთ დანაშაულის ადგილას აღმოჩენილი თმის ღერიდან და გაქვთ სამი ეჭვმიტანილის დნმ-ის ნიმუშებიც. თქვენ გევალებათ, შეისწავლოთ ერთ-ერთი გენეტიკური მარკერი და დაადგინოთ, ამ სამი ეჭვმიტანილიდან რომელიმეს დნმ ხომ არ ემთხვევა თმის ღერისას ამ მარკერის მიხედვით.
ამ მარკერის ორი ალელი, ანუ ვარიანტი, არსებობს. ერთ მათგანს ერთი განმეორებადი თანმიმდევრობა აქვს (ყავისფერი უბანი ქვემოთ), მეორეს კი - ორი ცალი. პჯრ-ში გამოიყენეთ სამიზნე უბნის შემომსაზღვრავი პრაიმერები და შედეგად, პირველი ალელისგან მიიღეთ 200 start text, ფ, წ, end text სიგრძის დნმ-ფრაგმენტი, მეორესგან კი - 300 start text, ფ, წ, end text სიგრძისა:
თქვენ დნმ-ის ოთხივე ნიმუშის პჯრ-ს ატარებთ და შედეგების ვიზუალიზაციისთვის გელ-ელექტროფორეზს იყენებთ, რაც ქვევითაა წარმოდგენილი:
მეტი პჯრ-ისა და სასამართლო მედიცინის შესახებ
დანაშაულის ადგილიდან აღებული დნმ-ის გამოკვლევის პრინციპები სინამდვილეშიც ზედა მაგალითში მოყვანილის მსგავსია, თუმცაღა ერთის ნაცვლად სასამართლო ექსპერტები მრავალ სხვადასხვა მარკერს შეისწავლიან და მათი მიხედვით ადარებენ ერთმანეთს დანაშაულის ადგილისა და ეჭვმიტანილების დნმ ნიმუშებს.
ამასთანავე, სასამართლო ექსპერტიზაში გამოყენებულ მარკერებს მხოლოდ ორ-ორი ვარიანტი, ანუ ალელი, სულაც არ აქვთ. ისინი ძლიერ პოლიმორფულია (poly = მრავალი, morph = ფორმა), ანუ, მათ მრავალი სხვადასხვა ალელი აქვთ სიგრძეთა უმცირესი სხვაობებით.
სასამართლო ექსპერტიზაში ყველაზე ხშირად გამოყენებული მარკერების სახეს მოკლე ტანდემური გამეორებები (ინგლ. short tandem repeats - STR-ები) ეწოდება. ისინი ნუკლეოტიდთა მოკლე თანმიმდევრობის (2-5 ნუკლეოტიდის სიგრძის) მრავალი განმეორებისგან შედგება. STR-ის ერთ ალელში შესაძლოა, 20 გამეორება იყოს, მეორეში - 18, მესამეში კი - 10start superscript, 1, end superscript.
მრავალი სხვადასხვა ალელის მქონე მრავალი მარკერის შესწავლით სასამართლო ექსპერტიზაში შესაძლებელია დნმ-ის ნიმუშისგან უნიკალური გენეტიკური „თითის ანაბეჭდის" მიღება. STR-ის ტიპურ ანალიზში 13 მარკერის გამოყენებით ცრუ დადებითი შედეგის ალბათობა (ანუ იმის, რომ ორ ადამიანს ერთნაირი დნმ-ანაბეჭდი ექნება) 10 start text, მ, ი, ლ, ი, ა, რ, დ, შ, ი, end text 1-ზე ნაკლებია start superscript, 1, end superscript!
მიუხედავად იმისა, რომ დნმ დამნაშავეების გამოვლენასა და დასჯასთან ასოცირდება, მისი წყალობით მრავალი ტყუილუბრალოდ დაპატიმრებული ადამიანიც გათავისუფლდა (ზოგი მათგანი მრავალი წელი იხდიდა სასჯელს). სასამართლო ექსპერტიზა გამოიყენება მამობის დადგენისა და კატასტროფების ადგილზე აღმოჩენილი გვამების იდენტიფიცირებისთვის.
გსურთ, შეუერთდეთ დისკუსიას?
პოსტები ჯერ არ არის.