If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

თუ ვებფილტრს იყენებთ, დარწმუნდით, რომ *.kastatic.org და *.kasandbox.org დომენები არ არის დაბლოკილი.

ძირითადი მასალა

დნმ-ის სეკვენირება

როგორ განისაზღვრება დნმ-ის მონაკვეთში ნუკლეოტიდების (ა, თ, ც, გ) თანმიმდევრობა.

საკვანძო საკითხები:

  • დნმ-ის სეკვენირება არის დნმ-ის ფრაგმენტში არსებული ნუკლეოტიდების (ადენინების, თიმინების, ციტოზინებისა და გუანინების) მიმდევრობის განსაზღვრის პროცესი.
  • სანგერის მეთოდის (სეკვენირების) დროს სამიზნე დნმ რამდენჯერმე კოპირდება და სხვადასხვა სიგრძის ფრაგმენტებს წარმოქმნის. ფლუორესცენციული „ჯაჭვის გამწყვეტი“ ნუკლეოტიდები ნიშნავენ ფრაგმენტების ბოლოებს და ამ მიმდევრობის განსაზღვრის საშუალებას იძლევიან.
  • მომავალი თაობის სეკვენირების ტექნიკები ახალი, ფართომასშტაბიანი მიდგომებია, რომლებიც ზრდის დნმ-ის სეკვენირების სიჩქარეს და ამცირებს მის დანახარჯებს.

რა არის სეკვენირება?

შესაძლოა, გსმენიათ გენომების სეკვენირების შესახებ. მაგალითად, ადამიანის გენომი 2003 წელს დასრულდა, მრავალწლიანი საერთაშორისო მცდელობების შემდეგ. მაგრამ რას ნიშნავს გენომის ან თუნდაც დნმ-ის მცირე ფრაგმენტის სეკვენირება?
დნმ-ის სეკვენირება არის დნმ-ის ფრაგმენტში არსებული ნუკლეოტიდების (ადენინების, თიმინების, ციტოზინებისა და გუანინების) მიმდევრობის განსაზღვრის პროცესი. დღესდღეობით შესაფერისი აღჭურვილობისა და მასალების არსებობის პირობებში, დნმ-ის მცირე ფრაგენტების სეკვენირება შედარებით მარტივი პროცესია.
მთლიანი გენომის (ორგანიზმის მთელი დნმ-ის) სეკვენირება ჯერ კიდევ რთულ ამოცანას წარმოადგენს. ამ პროცესისთვის საჭიროა გენომის დნმ-ის მცირე ნაწილებად დაშლა, ამ ნაწილების სეკვენირება და მათი მიმდევრობების ერთ გრძელ „კონსენსუსად“ შეერთება. მიუხედავად ამისა, გასულ ორ ათწლეულში შემუშავებული მეთოდების წყალობით, გენომის სეკვენირება ახლა გაცილებით უფრო სწრაფი და ნაკლებდანახარჯიანია, ვიდრე ეს „ადამიანის გენომის პროექტის“ (ინგლ. Human Genome Project) დროს იყო1.
ამ სტატიაში ჩვენ განვიხილავთ დნმ-ის სეკვენირებისას გამოყენებულ მეთოდებს. მთავარ აქცენტს გავაკეთებთ ერთ-ერთ ყველაზე გავრცელებულ მეთოდზე, სანგერის სეკვენირებაზე, თუმცა მის გარდა განვიხილავთ აგრეთვე სეკვენირების ახალ („მომავალი თაობის“) მეთოდებს, რომლებმაც შეამცირეს ფართომასშტაბიანი სეკვენირების დანახარჯები და გაზარდეს მისი სიჩქარე.

სანგერის სეკვენირება: ჯაჭვის გაწყვეტის მეთოდი

აზოტოვანი ფუძეების დაახლოებით 900 წყვილამდე დნმ-ის რეგიონები რუტინულად სეკვენირდება იმ მეთოდის მეშვეობით, რომელსაც სანგერის სეკვენირება ან ჯაჭვის გაწყვეტის მეთოდი ეწოდება. სანგერის მეთოდი 1977 წელს შეიმუშავეს ბრიტანელმა ბიოქიმიკოსმა ფრედ სანგერმა და მისმა კოლეგებმა.
„ადამიანის გენომის პროექტის“ ფარგლებში სანგერის სეკვენირება გამოიყენებოდა ადამიანის დნმ-ის შედარებით მცირე ზომის ფრაგმენტების მიმდევრობების განსასაზღვრად (ეს ფრაგმენტები აუცილებლად 900 ფწ ან ნაკლები არ იყო, თუმცა მკვლევრები ახერხებდნენ თითოეული ფრაგმენტის „გავლას“ სანგერის სეკვენირების რამდენიმე წრის მეშვეობით). ეს ფრაგმენტები ურთიერთგადამფარავი ნაწილების მიხედვით დალაგდა, რათა ერთად შეკრულიყო დნმ-ის უფრო დიდი რეგიონების მიმდევრობები და, საბოლოოდ, მთლიანი ქრომოსომები.
მართალია, ამჟამად გენომები, როგორც წესი, სხვა მეთოდების გამოყენებით სეკვენირდება, რომლებიც უფრო სწრაფი და ნაკლებდანახარჯიანია, მაგრამ სანგერის სეკვენირება ჯერ კიდევ ფართოდ გამოიყენება დნმ-ის ცალკეული ნაწილების მიმდევრობების განსასაზღვრად, მაგალითად, დნმ-ის კლონირებისას გამოყენებული ფრაგმენტებისა თუ პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციით (პჯრ-ით) გენერირებულებისა.

სანგერის სეკვენირების კომპონენტები

სანგერის სეკვენირება მოიცავს დნმ-ის სამიზნე რეგიონის მრავალი ასლის წარმოქმნას. მისი კომპონენტები იგივეა, რაც ორგანიზმში დნმ-ის რეპლიკაციისთვისაა საჭირო ან პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციისთვის (პჯრ-სთვის), რომელიც დნმ-ს in vitro აკოპირებს. ეს პროცესები მოიცავს:
  • ფერმენტ დნმ-პოლიმერაზას
  • პრაიმერს, რომელიც წარმოადგენს ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოკლე მონაკვეთს, რომელიც ებმის დნმ-ის თარგს და პოლიმერაზას „გამშვების“ როლს ასრულებს
  • დნმ-ის ოთხ ნუკლეოტიდს (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
  • თარგს დნმ-ისა, რომლის სეკვენირებაც უნდა მოხდეს
მიუხედავად ამისა, სანგერის სეკვენირების რეაქცია უნიკალურ კომპონენტსაც შეიცავს:
  • ოთხივე ნუკლეოტიდის დიდეზოქსურ, ანუ ჯაჭვის გამწყვეტ (მატერმინირებელ), ვერსიას (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), რომელთაგან თითოეულიც სხვადასხვაფრადაა შეღებული
_სურათის წყარო: „მთლიანი გენომის სეკვენირება: სურათ 1“, ოპენსტაქსის კოლეჯი, ბიოლოგია (CC BY 4,0)._
დიდეზოქსინუკლეოტიდები არის ჩვეულებრივი, დეზოქსინუკლეოტიდების მსგავსი, თუმცა მათ ერთი საკვანძო განსხვავება ახასიათებთ: მათ არ აქვთ ჰიდროქსილის ჯგუფი შაქრის რგოლის 3’ ნახშირბადზე. ჩვეულებრივ ნუკლეოტიდში 3’ ჰიდროქსილის ჯგუფი „კაუჭივით“ მოქმედებს და არსებულ ჯაჭვში ახალი ნუკლეოტიდის დამატების საშუალებას იძლევა.
როდესაც ჯაჭვს დიდეზოქსინუკლეოტიდი ემატება, ჰიდროქსილი აღარ არის ხელმისაწვდომი და, შესაბამისად, ვერ მოხერხდება ახალი ნუკლეოტიდების შემოერთება. ჯაჭვი სრულდება დიდეზოქსინუკლეოტიდით, რომელიც ცალკეული ფერითაა მონიშნული და ეს ფერი დამოკიდებულია იმ ფუძეზე (ა, თ, ც ან გ), რომელსაც დიდეზოქსინუკლეოტიდი ატარებს.

სანგერის სეკვენირების მეთოდი

ნიმუში დნმ-ისა, რომლის სეკვენირებაც უნდა მოხდეს, სინჯარაში თავსდება პრაიმერთან, დნმ-პოლიმერაზასა და დნმ-ის ნუკლეოტიდებთან (dATP, dTTP, dGTP და dCTP) ერთად. სინჯარაში ემატება აგრეთვე საღებავით მონიშნული და ჯაჭვის გამწყვეტი ოთხი დიდეზოქსინუკლეოტიდი, თუმცა გაცილებით უფრო ნაკლები ოდენობით, ვიდრე ჩვეულებრივი ნუკლეოტიდები.
ნარევი ჯერ უნდა გაცხელდეს, რომ დნმ-ს ნიმუშის დენატურაცია მოხდეს (ჯაჭვები განცალკევდეს), შემდეგ კი უნდა გაგრილდეს, რომ პრაიმერი დაუკავშირდეს ერთჯაჭვიან ნიმუშს. პრაიმერის დაკავშირების შემდეგ ტემპერატურა ისევ იზრდება და დნმ-პოლიმერაზა ასინთეზირებს ახალ დნმ-ს პრაიმერიდან. დნმ-პოლიმერაზა განგრძობითად დაამატებს ნუკლეოტიდებს ჯაჭვს, სანამ ჩვეულებრივი ნუკლეოტიდის ნაცვლად დიდეზოქსინუკლეოტიდს არ დაამატებს. ამის შემდეგ ნუკლეოტიდები ვეღარ ემატება და ჯაჭვი მთავრდება დიდეზოქსინუკლეოტიდით.
ეს პროცესი რამდენიმეჯერ მეორდება. ამ წრებრუნვის მიწურულს, ფაქტობრივად, გარანტირებულია, რომ დიდეზოქსინუკლეოტიდი სამიზნე დნმ-ის ყველა პოზიციაში იქნება ჩასმული მინიმუმ ერთ რეაქციაში მაინც. ეს ნიშნავს, რომ სინჯარაში ბოლოს აღმოჩნდება სხვადასხვა სიგრძის ფრაგმენტები, რომლებიც სრულდება საწყისი დნმ-ის ნუკლეოტიდების თითოეულ პოზიციაზე (იხილეთ ქვემოთ მოცემული სურათი). ამ ფრაგმენტების ბოლოები მონიშნული იქნება საღებავებით, რომლებიც საბოლოო ნუკლეოტიდის იდენტიფიცირების საშუალებას მოგვცემს.
სახეცვლილი სურათის ორიგინალია „სანგერის სეკვენირება“, Estevezj (CC BY-SA 3,0). სახეცვლილი სურათი ვრცელდება (CC BY-SA 3,0) ლიცენზიით.
რეაქციის დასრულების შემდეგ ეს ფრაგმენტები ეშვება გრძელ, ვიწრო სინჯარაში, რომელიც გელს შეიცავს, და იწყება კაპილარული გელ-ელექტროფორეზის პროცესი. მოკლე ფრაგმენტები გელის ფორებში სწრაფად მოძრაობენ, გრძელი ფრაგმენტები კი — უფრო ნელა. როდესაც თითოეული ფრაგმენტი „ფინიშის ხაზს“ გადაკვეთს სინჯარის ბოლოში, სინჯარა ლაზერით ნათდება, რაც საღებავებით მონიშნული ნაწილების გამოაშკარავების საშუალებას იძლევა.
ყველაზე პატარა ფრაგმენტი (პრაიმერის შემდეგ ერთ ნუკლეოტიდში მთავრდება) ფინიშის ხაზს პირველი კვეთს. მას მოსდევს შემდეგი ყველაზე პატარაა ფრაგმენტი (პრაიმერის შემდეგ ორ ნუკლეოტიდში მთავრდება) და ა. შ. შესაბამისად, დეტექტორზე დაფიქსირებული საღებავების ფერებისგან შეგვიძლია, აღვადგინოთ დნმ-ს თანმიმდევრობა თითო-თითო ნუკლეოტიდით. მონაცემები, რომელსაც დეტექტორი იწერს, არის პიკები ფლუოროსცენციის ინტენსივობაში, როგორც ნაჩვენებია ზემოთ ქრომატოგრამზე. დნმ-ს თანმიმდევრობა ამოიკითხება ქრომატოგრამზე არსებული პიკებიდან.

გამოყენებები და შეზღუდვები

სანგერის სეკვენირება გვაძლევს მიმდევრობის მაღალხარისხიანად განსაზღვრის საშუალებას დნმ-ის შედარებით გრძელი მონაკვეთებისთვის (ფუძეთა 900 წყვილამდე). ის, როგორც წესი, გამოიყენება დნმ-ის ცალკეული ნაწილების სეკვენირებისთვის, მაგალითად, როგორებიცაა ბაქტერიული პლაზმიდები ან პჯრ-ში დაკოპირებული დნმ.
მიუხედავად ამისა, სანგერის სეკვენირება საკმაოდ ძვირადღირებული და არაეფექტიანია ფართომასშტაბიანი პროექტებისთვის, როგორიცაა, მაგალითად, მთლიანი გენომისა თუ მეტაგენომის (მიკრობული თანასაზოგადოების „კოლექტირუი გენომის) სეკვენირება. ამგვარი ამოცანებისთვის არსებობს ახალი, ფართომასშტაბიანი სეკვენირების ტექნიკები, რომლებიც უფრო სწრაფი და ნაკლებდანახარჯიანია.

მომავალი თაობის სეკვენირება

სახელი, ალბათ, „ვარსკვლავური გზის“ სათაურივით ჟღერს, მაგრამ მართლა ასე ჰქვია! დნმ-ის სეკვენირების ბოლოდროინდელ ტექნოლოგიებს კოლექტიურად მომავალი თაობის სეკვენირებას უწოდებენ.
მომავალი თაობის სეკვენირების მრავალი ტექნიკა არსებობს და ისინი განსხვავებულ ტექნოლოგიებს იყენებს. მიუხედავად ამისა, მრავალ მათგანს საერთო აქვს წყება იმ მახასიათებლებისა, რომლებითაც ისინი სანგერის სეკვენირებისგან განსხვავდება:
  • მეტად თანადროული: სეკვენირების მრავალი რეაქცია ერთდროულად ხდება
  • მიკრო მასშტაბი: რეაქციები ძალიან პატარაა და მრავალი მათგანის განხორციელება პირდაპირ ერთ ჩიპზეა შესაძლებელი
  • სწრაფი: რეაქციების პარალელურად განხორციელების წყალობით, შედეგები გაცილებით უფრო სწრაფად მიიღება
  • დაბალდანახარჯიანი: გენომის სეკვენირება უფრო იაფია, ვიდრე სანგერის სეკვენირების შემთხვევაში
  • უფრო მოკლე სიგრძე: როგორც წესი, შეუძლია 50-700 ნუკლეოტიდის სიგრძის მონაკვეთების წაკითხვა
არსობრივად, მომავალი თაობის სეკვენირება სანგერის სეკვენირების ძალიან ბევრი მცირე რეაქციის ერთდროულად გაშვებას ჰგავს. ამ თანადროულობისა და პატარა მასშტაბის წყალობით, მომავალი თაობის მეთოდების მეშვეობით დნმ-ის დიდი რაოდენობით სეკვენირებაა შესაძლებელი გაცილებით უფრო სწრაფად და იაფად, ვიდრე ეს სანგერის სეკვენირების შემთხვევაში იყო. მაგალითად, 2001 წელს ადამიანის გენომის სეკვენირების ხარჯებმა თითქმის $100 მილიონი შეადგინა, 2015 წელს კი ამისთვის მხოლოდ $1245 დაიხარჯა2!
რატომ არის მნიშვნელოვანი სწრაფი და იაფი სეკვენირება? გენომების რუტინულად სეკვენირების უნარი ახალ შესაძლებლობებს აჩენს ბიოლოგიურ კვლევებსა და ბიოსამედიცინო პრაქტიკაში. მაგალითად, დაბალდანახარჯიანი სეკვენირება წინ გადადგმული ნაბიჯია პერსონალიზებულ მედიცინაში, რაც გულისხმობს ინდივიდის საჭიროებებს მორგებულ სამედიცინო მკურნალობას, რომელიც ამ პაციენტის გენომში არსებული გენების ვარიანტების მიხედვით განისაზღვრება.

გსურთ, შეუერთდეთ დისკუსიას?

პოსტები ჯერ არ არის.
გესმით ინგლისური? დააწკაპუნეთ აქ და გაეცანით განხილვას ხანის აკადემიის ინგლისურენოვან გვერდზე.