თუ თქვენ ხედავთ ამ შეტყობინებას, ესე იგი საიტზე გარე რესურსების ჩატვირთვისას მოხდა შეფერხება.

If you're behind a web filter, please make sure that the domains *.kastatic.org and *.kasandbox.org are unblocked.

ძირითადი მასალა

რესტრიქციული ფერმენტები და დნმ-ლიგაზა

რესტრიქციული დაქუცმაცება. წებოვანი და ბლაგვი ბოლოები. ლიგაციის რეაქციები.

საკვანძო საკითხები:

  • რესტრიქციული ფერმენტები დნმ-ის ჯაჭვს ჭრიან. თითოეული მათგანი ერთ ან რამდენიმე სამიზნე თანმიმდევრობას ამოიცნობს და ჯაჭვს მათთან ახლოს ამოჭრის.
  • მრავალი რესტრიქციული ფერმენტის მოქმედების შედეგად დნმ-ის „უსწორმასწორო" მოლეკულები მიიღება, ანუ მათი ბოლოებიდან ცალფა ჯაჭვებია გამოჩრილი. ზოგი რესტრიქციული ფერმენტი კი გაჭრისას გლუვბოლოებიან მოლეკულებს ქმნის.
  • დნმ-ლიგაზა დნმ-ის ჯაჭვების შემაწებებელი ფერმენტია. თუ დნმ-ის ორ უბანს შესაბამისი ბოლოები აქვს, ლიგაზას მათი გადაბმა და ერთ მოლეკულად გაერთიანება შეუძლია.
  • დნმ-ის კლონირებისას გენებისა და სხვა თანმიმდევრობების პლაზმიდში ჩასანერგად რესტრიქციული ფერმენტები და დნმ-ლიგაზა გამოიყენება.

როგორ დავჭრათ და დავაწებოთ დნმ?

დნმ-ის კლონირებისას მკვლევარები დნმ-ის ერთი უბნის, მაგალითად გენის, მრავალ ასლს ამზადებენ. ხშირად კლონირება მოიცავს ამ გენის შეყვანას დნმ-ის წრიულ მოლეკულაში, პლაზმიდში, რომლის ასლებსაც შემდეგ ბაქტერიები დაამზადებენ.
როგორ შეიძლება სხვადასხვა წყაროდან (მაგალითად, ადამიანის გენი და ბაქტერიული პლაზმიდი) მიღებული დნმ-ის მოლეკულების ერთმანეთთან შეწებება და ერთიანი მოლეკულის მიღება? ამისთვის საკმაოდ ხშირად რესტრიქციულ ფერმენტებსა და დნმ-ლიგაზას იყენებენ.
  • რესტრიქციული ფერმენტი დნმ-ის სპეციფიკურ უბნებს ამოიცნობს და ჭრის მათ. მრავალი მათგანი ამოცნობის უბანზე ან მასთან ახლოს არათანაბრად ჭრის დნმ-ს, რის გამოც გაჭრილი მოლეკულის ბოლოდან ცალფა ჯაჭვებია ხოლმე „გამოჩრილი".
  • თუ დნმ-ის ორ მოლეკულას შესაბამისი ბოლოები აქვს, დნმ-ლიგაზას შეუძლია მათი ერთმანეთთან შეწებება. ეს ფერმენტი ჯაჭვებს გადააბამს და ერთი მთლიანი დნმ მიიღება.
რესტრიქციული ფერმენტები და დნმ-ლიგაზა ხშირად გამოიყენება გენებისა და დნმ-ის სხვა უბნების შესაყვანად პლაზმიდებში კლონირებისას.

რესტრიქციული ფერმენტები

რესტრიქციული ფერმენტები ბაქტერიებში (და სხვა პროკარიოტებში) გვხვდება. ისინი ამოიცნობენ და უკავშირდებიან დნმ-ის სპეციფიკურ თანმიმდევრობებს, რესტრიქციის უბნებს. თითოეული ფერმენტს ერთი ან რამდენიმე ასეთი უბნის ამოცნობა შეუძლია. დაკავშირების შემდეგ რესტრიქციული ფერმენტი დნმ-ის ორჯაჭვიან მოლეკულას ჭრის ამოცნობილ უბანზე ან მის ახლომახლოს, მოწესრიგებული, წინასწარ დადგენილი წესის მიხედვით.
იმის უკეთ გასაგებად, როგორ ამოიცნობს და ჭრის დნმ-ის თანმიმდევრობას რესტრიქციული ფერმენტი, მოდით, განვიხილოთ EcoRI - ლაბორატორიებში ხშირად გამოყენებული რესტრიქციული ფერმენტი. EcoRI შემდეგ უბანს ჭრის:
ამოცნობის შემდეგ EcoRI ამ უბანს ყოველთვის ერთნაირად, წინასწარ განსაზღვრული წესის მიხედვით ჭრის ისე, რომ მიღებული მოლეკულების ბოლოებიდან დნმ-ის ცალფა ჯაჭვებია გამოჩრილი:
თუ დნმ-ის სხვა მოლეკულას შესაბამისი ბოლოები აქვს (მაგ. თუ ისიც EcoRI-ის მიერაა დაჭრილი), კომპლემენტარული ნუკლეოტიდების დაწყვილება და ბოლოების შეერთება შესაძლებელია. ამის გამო, თუ ფერმენტი გაჭრისას ბოლოში ცალფაჯაჭვებიან მოლეკულებს წარმოქმნის, ვამბობთ, რომ წებოვანი ბოლოები მივიღეთ. წებოვანი ბოლოები გამოსადეგია კლონირებაში, რადგან მათი მეშვეობით დნმ-ის ორი ჯაჭვის შეწებებაა შესაძლებელი დნმ-ლიგაზას მეშვეობით.
ყველა რესტრიქციული ფერმენტი არ წარმოქმნის წებოვან ბოლოებს. ზოგი „ბლაგვად ჭრის", ანუ ზუსტად შუაში ჩაჭრის სამიზნე თანმიმდევრობას და ბოლოებიდან გამოჩრილი ჯაჭვები არ მიიღება. ერთ-ერთი ასეთი რესტრიქციული ფერმენტია SmaI:
გლუვბოლოებიან ფრაგმენტებსაც დნმ-ლიგაზა აწებებს ერთმანეთთან, თუმცა მათი შეერთება უფრო ძნელია (ლიგაციის რეაქცია ნაკლებეფექტურია და მეტია იმის ალბათობა, რომ ის ვერ განხორციელდეს). ასეთ ფრაგმენტებს ხომ წებოვანი ბოლოები არ აქვთ და ერთმანეთის პირისპირ კარგად ვერ ფიქსირდებიან, რათა ფერმენტმა რეაქციის კატალიზება შეძლოს.

დნმ ლიგაზა

თუ დნმ-ის რეპლიკაცია უკვე გავლილი გაქვთ, ალბათ, დნმ-ლიგაზაც გაგიგიათ. რეპლიკაციის პროცესში ლიგაზას დნმ-ის ახლადწარმოქმნილი ფრაგმენტების შეწებება და მთლიანი ჯაჭვის აწყობა ევალება. დნმ-ის კლონირებაში გამოყენებული ლიგაზებიც ამას აკეთებენ. თუ დნმ-ის ორ ჯაჭვს შესაბამისი ბოლოები აქვს, ლიგაზას მათი ერთ მოლეკულად შეწებება შეუძლია.
როგორ ახერხებს დნმ-ლიგაზა ამას? ეს ფერმენტი ენერგიის წყაროდ ატფ-ს იყენებს და აკატალიზებს რეაქციას, რომლის დროსაც დნმ-ის ერთი ჯაჭვის 5' ბოლოდან გამოჩრილი ფოსფატის ჯგუფი მეორე ჯაჭვის 3' ბოლოდან გამოჩრილ ჰიდროქსილის ჯგუფს უკავშირდება. რეაქციის შედეგად შაქარ-ფოსფატური ხერხემალი წარმოიქმნება.

მაგალითი: რეკომბინანტული პლაზმიდის მიღება

მოდით, ვნახოთ, როგორ გამოიყენება რესტრიქცია და ლიგაცია (ამოჭრა და ჩაწებება) გენის პლაზმიდში ჩასართავად. ვთქვათ, გვაქვს სამიზნე გენი, რომელიც მდებარეობს ამოცნობის საიტ EcoRI-ებს შორის და პლაზმიდი, რომელსაც ერთი EcoRI საიტი აქვს:
ჩვენი მიზანია ფერმენტი EcoRI-ის გამოყენება გენის პლაზმიდში ჩასასმელად. პირველ რიგში, EcoRI-ის გამოყენებით გენის შემცველი დნმ-ფრაგმენტი ამოვჭრათ, პლაზმიდი კი გავჭრათ. შედეგად მიიღება წებოვანი ბოლოების მქონე ფრაგმენტები:
ამის შემდეგ გენსა და აწ უკვე ხაზოვან (გაჭრილ) პლაზმიდს დნმ-ლიგაზას მეშვეობით ვაწებებთ. ორი ფრაგმენტის წებოვანი ბოლოები კომპლემენტარული ნუკლეოტიდების დაწყვილების გზით უკავშირდება ერთმანეთს:
ლიგაზას მიერ შეწებების შემდეგ, ფრაგმენტები დნმ-ის ერთიან მოლეკულას ქმნიან. სამიზნე გენი ახლა უკვე პლაზმიდშია ჩაშენებული და მიღებულ პლაზმიდს რეკომბინანტული ეწოდება.

რესტრიქცია და ლიგაცია დნმ-ის მრავალ მოლეკულას მოიცავს

ზემოთ განხილულ მაგალითში ვნახეთ, რა შედეგი მიიღებოდა EcoRI-ით გაჭრილი გენისა და პლაზმიდის შეწებებით, თუმცა ზუსტად ამავე პროცესს სხვანაირი შედეგიც შეიძლება ჰქონდეს. მაგალითად, გაჭრილი პლაზმიდი შეიძლება, გენის ჩართვის გარეშე დაიხუროს (ისევ წრიული გახდეს). შესაძლოა, გენი ჩაერთოს პლაზმიდში, მაგრამ უკუღმა, საპირისპირო მიმართულებით ჩაჯდეს (რადგანაც ორი EcoRI წებოვანი ბოლო იდენტურია).
რესტრიქცია და ლიგაცია პლაზმიდისა და გენის მრავალი ასლის გამოყენებით ტარდება ლაბორატორიებში. მეტიც, ერთ ლიგაციას დნმ-ის მილიონობით მოლეკულა სჭირდება! ეს მოლეკულები ერთმანეთსა და დნმ-ლიგაზას მრავალი სხვადასხვანაირინ კუთხით ეჯახებიან. შესაბამისად, მათგან მრავალნაირი „პროდუქტი", ანუ საბოლოო შედეგი, მიიღება თანაბარი სიხშირით, ისეთებიც, რომლებიც არ გვჭირდება.
როგორ ავიცილოთ თავიდან „ცუდი" პლაზმიდების წარმოქმნა? როცა ბაქტერიების ტრანსფორმაციას ვატარებთ დნმ-ის ლიგაციის გზით, თითოეული ბაქტერია დნმ-ის სხვადახვა უბანს მიიტაცებს. ტრანსფორმაციის შემდეგ ამ ბაქტერიებს ვიკვლევთ და მათგან მხოლოდ იმათ ამოვარჩევთ, რომლებსაც ჩვენთვის საინტერესო პლაზმიდი აქვთ. ხშირად ტრანსფორმირებული ბაქტერიების პლაზმიდებს სხვა რესტრიქციული ფერმენტის გამოყენებით იკვლევენ, რათა დაადგინონ, მასში სწორი დნმ სწორი თანმიმდევრობით თუა ჩასმული.

გსურთ, შეუერთდეთ დისკუსიას?

პოსტები ჯერ არ არის.
გესმით ინგლისური? დააწკაპუნეთ აქ და გაეცანით განხილვას ხანის აკადემიის ინგლისურენოვან გვერდზე.